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豬外周血造血干細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)

豬外周血造血干細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
A．適用儀器
zui大離心力可達(dá) 1200g的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
B．耗材

【檢驗(yàn)方法】
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
首先取抗凝血按體積比 1:1的比例加樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119）混勻，
根據(jù)稀釋后的樣本量大小，分以下兩種情況：
情況 A：稀釋后的血液樣本量小于5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1.取一支15ml離心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液（注：分離液zui少不得少于  3ml）。
2.用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-500g，離心20-30min（注：
根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離
心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果）。
 3.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色目的

細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一 15ml離心管中，往所得離心管中
加入 10ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心 10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8. 250g，離心 10min。
9.重復(fù)  6、7、8，棄上清后以 0.5ml后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
10.差異貼壁法純化細(xì)胞
（1）用干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基或干細(xì)胞*培養(yǎng)基以 1.5-3×10 6個(gè)/ml的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
（2）2-4小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱(chēng)為單核細(xì)胞）。
（3）10-24小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
注：
a)
無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加10%自體血漿或
2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。
b)
c)
*培養(yǎng)基中含 2-20% 胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。
由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開(kāi)已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的，此法成
本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰
性分選。
情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1.取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液。
2.將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，450-650g（zui大離心力可至 1000g），
離心 20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心
時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果。加入血液樣本后，樣
本及分離液總體積不得超過(guò)離心管總體積的三分之二）。
3.剩余步驟同“情況  A”中步驟 3至步驟  10。
  【注意事項(xiàng)】

1.全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在   20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，
在取血 2h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò)   6h
后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2.本實(shí)驗(yàn)不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心
管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)
變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3.吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒
細(xì)胞數(shù)量增加。
4.吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
5.分離液用量大于稀釋后的血液樣本時(shí)，分離效果更佳。
6.如實(shí)驗(yàn)后干細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)以尋求幫助。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)外周血干細(xì)胞提取率大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
1.所獲得干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2.所獲得干細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
3.所獲得干細(xì)胞的鑒定方法
A.流式細(xì)胞技術(shù)
B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR技術(shù)

注：上述技術(shù)方案詳情請(qǐng)登陸本搜索“細(xì)胞分離、
純化、擴(kuò)增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊(cè)”，并在說(shuō)明書(shū)項(xiàng)目欄下下載使用。
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離
心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3.本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g為基數(shù)，直至達(dá)到分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min為準(zhǔn)。